年，Woiff等首次证实，体外合成的mRNA经肌肉注射至小鼠体内后有活性蛋白产生。这就是mRNA疫苗的雏形。
但mRNA自身稳定性差、易被体内的核酸酶降解是制约其发展的瓶颈。因此，mRNA疫苗需要有合适的递送载体将其递送至体内，才能有更好的免疫效果，开发高效无毒的递送系统是mRNA疫苗成功的关键。
生辉此前已经总结了上述几类RNA药物的要点（点击查看《瓶颈》）。本文将着重分析mRNA疫苗的递送究竟有那几道难题要解答？
第一题：递送载体
相比于DNA疫苗，mRNA疫苗无需进入细胞核，无整合到基因组的风险，相对更安全。mRNA疫苗既可作为预防性疫苗预防流感等感染性疾病，也可作为治疗性疫苗治疗如癌症等重大疾病。
目前mRNA疫苗主要包括非复制型mRNA和病毒衍生的自我扩增型mRNA(self-amplifyingmRNA，SAM，图1)。
图丨非复制型mRNA(A)和病毒衍生的自我扩增型mRNA(SAM)(B)结构组成（来源：JIntPharmRes，Vol.46，No.5，May，）
非复制型mRNA是利用体外转录技术合，与真核生物mRNA分子结构一致，主要由5非翻译区（untranslatedregion,UTR）、开放阅读框（openreadingframe,ORF）、3非翻译区、5帽子结构（Cap）和-bp多聚腺苷酸尾巴（Poly(A）)组成。5-UTR和3-UTR中的调节元件可稳定mRNA并增加抗原蛋白质翻译。ORF是含有编码抗原的核酸序列，Cap能使mRNA沿着正确的方向进行翻译。Poly(A）能增加mRNA的稳定性和抗原蛋白的表达，对mRNA的翻译和稳定性具有重要作用，可经Poly(A）聚合酶添加到mRNA上。mRNA的合成一般是以含靶蛋白ORF的质粒为模板，经体外转录合成，最后再加上5Cap和3端Poly(A）。体外合成的mRNA进入细胞后，在核糖体上进行翻译，形成功能性蛋白。
病毒衍生的自我扩增型mRNA（SAM）是将编码抗原的核酸序列直接插入单链RNA病毒中(如塞姆利基森林病毒、黄热病毒等)，通常相对分子质量比较大，能表达大量的抗原。目前使用的SAM疫苗大多基于甲病毒基因组，其中编码mRNA复制机制的基因是完整的，只是编码结构蛋白的基因被目的基因替换，利用DNA模板经体外转录技术即易得到。
mRNA疫苗递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体。以慢病毒、腺相关病毒、仙台病毒等载体为主的病毒载体虽能进行核酸递送，但可能会因载体引起的免疫反应而受到限制，影响其应用。
而非病毒载体主要包括脂质体、树突细胞(dendriticcell,DC)、无机纳米粒子、阳离子细胞穿膜肽等。其中，脂质体递送mRNA具有独特优势:1）脂质体为球形囊泡，可将mRNA包裹在内，抵御核酸酶的作用；2）脂质体类似于细胞膜，易与受体细胞融合，转染效率高；3）脂质体可递送不同大小片段的mRNA；4）脂质体作为递送载体不受宿主限制。截至目前，脂质载体已成为递送mRNA最为有效的非病毒载体。常用的递送mRNA的脂质体材料见表1。
（来源：JIntPharmRes，Vol.46，No.5，May，）
目前，用于递送mRNA的非病毒载体中以脂质体应用的最为广泛，主要包阳离子括脂质体复合物(lipoplex，LP)、脂质体聚合物(lipopolyplex，LPR)、脂质体纳米粒(lipidnanoparticle，LNP)、阳离子纳米乳(cationicnanoemulsion，CNE)等。
最早使用的脂质体递送材料是阳离子脂质体。带正电荷的阳离子脂质体与带负电荷的mRNA通过经静电作用聚集形成多层囊状复合物，称为脂质体复合物(lipoplex，LP)，复合物中包封的mRNA不易被RNase降解，能被成功递送至细胞翻译成功能性蛋白。2-二油酰基羟丙基-3-N，N，N-三甲铵氯(DOTAP)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是已被证实有效的递送载体。
阳离子聚合物具有浓缩mRNA的作用，mRNA与聚合物浓缩后被阳离子脂质体包裹在囊状空腔中则形成脂质体聚合物(lipopolyplex，LPR)。LPR最早用于DNA转染，后来也用于siRNA和mRNA转染。
脂质体纳米粒LNP一般由被脂质双层壳包围的水性核心组成，脂质双层壳由不同的脂质组成，每种脂质都发挥着不同的功能。LNP是目前主流的递送载体之一，然而，早期的阳离子LNP在体内的应用仍然受到很大限制，比如容易被巨噬细胞清除和产生有害的活性氧簇ROS等。
为了解决这些问题，“可离子化”LNP的概念被提出。虽然大大促进了核酸药物的发展，但仍然不尽人意。纳米颗粒的体积比较大，一般需要静脉注射，只能有效进入肝脏，脾脏和肿瘤等空隙较大的组织。另外，LNP的过敏反应也比较严重，在注射之前需要使用抗组胺和激素药物控制。这些缺点让LNP药物只适用于罕见病和癌症等严重疾病。
Brito等使用阳离子纳米乳(cationicnanoemulsion，CNE)递送不同种类的SAM疫苗，该CNE配方是基于诺华专利佐剂MF59。相比于LNP，CNE已用于临床试验，具有更重要的临床意义。
即使许多药物（如生化药物抗癌抗真菌药物、基因药物、麻醉剂）通过脂质体进行递送，并取得了成功，但是由于脂质体本身存在一些缺点，如易氧化降解、制备重现率差等，大规模工业化生产不易实现等问题都有待解决，同时由于传统脂质纳米粒的开发过程进展缓慢，目前开发出来的有效递送载体非常有限。
而递送载体只是待破解的难题之一，与其正相关的给药机制同样不明朗。
第二题：给药方式
mRNA疫苗的给药方式非常重要，会决定mRNA疫苗在体内的代谢，及目的抗原蛋白翻译的效率。例如，如果直接静脉注射未经任何处理的裸露mRNA，就会被血液中的核酸酶迅速降解。
mRNA疫苗的给药分为系统给药或者局部给药，根据抗原蛋白需要表达的位置来决定（下图所示为系统给药和局部给药）。如果是预防性疫苗，为了引起较强的免疫反应，通常用皮下和肌肉注射的局部给药，如果是治疗性mRNA疫苗通常通过腹腔或者静脉注射系统给药。
图丨系统给药和局部给药（来源：BiomaterialsformRNAdelivery）
同时，对于脂质体递送mRNA来说，不同的给药途径对诱导蛋白表达、给药频率及副作用强度具有重要影响。如LNP递送可通过改变给药途径来改变mRNA体内表达量和持续时间，其中，肌注和皮内注射显示出比静脉注射更持久的蛋白表达。
研究表明，脂质体主要的给药方式有以下5种类。
1）静脉注射。一种全身给药的方式，药物经血液流经全身，药效发挥迅速，也是脂质体递送mRNA常用的给药方式。脂质体在静脉注射后首先被富含网状内皮细胞的组织(肝、脾)摄取，而后被单核巨噬细胞吞噬，少量被肺、骨髓摄取。因进入血液中的脂质体大小及电荷不同，其在血液中清除速率也不一样，大的脂质体清除速率要比小的快。静脉注射不可避免的缺点是脂质体中若残留有制备时产生的毒性溶剂，会对机体产生比其他给药方式更大的副作用。
2）皮下注射。是常规疫苗接种第二种最常用的给药方式。皮下注射是将mRNA递送至皮肤和骨骼肌之间，这种给药方式可直接转染mRNA至淋巴结中的DC，但皮下注射对剂量有一定的限制，若给药剂量过多需要分点注入，操作难度大。
3）肌肉注射。将mRNA递送至肌肉组织内。这种给药方式的优点是容易实现大剂量给药，但对粒径和电荷具有特殊的要求，粒径和电荷较大则会减少递送，影响药效。
4）皮内注射。可直接将脂质体递送至表皮和真皮之间。表皮和真皮之间具有大量免疫细胞(朗格汉细胞、DC亚型)，皮内注射给药可有效诱导Th1（辅助性T细胞1）型免疫应答。但其与皮下注射缺点相同，均无法实现大剂量给药，需要分点注射或多次给药才能达到所需治疗剂量。
5）DC细胞的转染。mRNA疫苗另外一种非常重要的给药方式是通过DC细胞的转染进行给药，分为体内和体外两种DC细胞介导的方式。DC细胞是人体重要的抗原递呈细胞，其摄取抗原后可以诱导随后的免疫反应。在体外分离得到人体未成熟的DC细胞后，可以通过电穿孔技术转染mRNA，再把转染后的DC细胞过继入人体，产生被动免疫。
但是通过体外DC转染的方式递送mRNA疫苗对技术的要求非常高，需要较长的体外培养时间，而且首先需要获取人体的DC细胞，在普通条件下难以实现。另外一个通过DC细胞给药的方式是淋巴内给药，mRNA被直接注射到淋巴内，这样mRNA就可以被淋巴内固有DC细胞获取，但是这种给药方式通常需要手术辅助，导致给药非常复杂且带了大量的风险。
综上所述，以上5种给药方式虽为常用的疫苗给药方式，但具有各自的优缺点，使用哪一种给药方式要根据具体情况分析。
现阶段，受制于递送效率，mRNA分子只有极少（0.01%）能成功进入细胞质并表达蛋白，因此大剂量给药仍是常态，将会带来较大的副作用。只有选择合适的给药方式，脂质体才能更好递送mRNA，使其以更小的剂量、更少的副作用，激发起更大的免疫效果。
第三题：专利护城河
全球范围内，尚无基于mRNA技术平台研发的治疗或预防性药物、疫苗获批上市。国外有“mRNA疫苗研发三巨头”：Moderna、CureVac、BioNTech，均采用脂质纳米技术递送（LNP），这也是目前在核酸药物领域应用比较广泛的递送技术类型。
其中，Moderna专注于mRNA药物的开发。这家公司创立；年正式运行；年上市，创造了美股史上最大生物科技公司IPO记录。但技术、专利本身存在的问题让Moderna一直处于风口浪尖。
最核心的争议是Moderna的核心技术及其专利保护能力。
首先是mRNA药物最为关键的递送问题。Moderna最初使用的脂质体技术会激活强烈的炎症反应和肝毒性(特别是在重复注射时)，直接导致了早期产品线的失败。
Moderna宣称在后续产品使用了自己开发的新型脂质体递送技术，然而，首个质疑的声音来自Arbutus——Arbutus怀疑Moderna至少在两个最领先的产品中非法使用了Arbutus的LNP递送技术，随后Arbutus提出了一场关乎Moderna关键产品命运的法律诉讼。
Moderna先后4次从获得Arbutus授权的Acuitas取得LNP技术的使用资格，然而，根据当初Arbutus与Acuitas的授权协议，Acuitas只在“antisense”和“genetherapy”两个领域拥有LNP技术的使用和二次授权权利，同时还限定了在二次授权时，所授权的产品必须由Acuitas开发、并已在动物模型中完成初步验证。因此，Arbutus指控Moderna与Acuitas的授权协议涉嫌重大违约：Acuitas将所有基于LNP技术的专利和技术要点都授权给Moderna，而不是当初限定的两个治疗领域，也不是由Acuitas开发并完成临床前验证的产品。
年2月，裁定结果剥夺了Acuitas继续使用和二次授权LNP技术的权益，Moderna可以庆幸的是虽然无法在其他领域使用LNP技术，之前获得授权的4个产品仍然保留了使用权，Moderna将向Arbutus支付费用。
Moderna申明现在使用的是公司内部研发的新型脂质体递送技术，但Arbutus表示根据Moderna所发表的文献、报告和专利分析提出，Moderna很难在不依靠Arbutus专利的情况下，开发出有效的脂质体递送技术。因此，不能排除Moderna将继续陷入专利战的可能。
Moderna的核苷修饰技术则是另一专利纠纷的焦点。
体外合成的mRNA具有较高的免疫原性，可能会诱发大量炎症反应。人体对mRNA的免疫反应主要和尿苷(部分由尿嘧啶组成)有关，而利用假尿嘧啶替代尿嘧啶就能够减少免疫系统对mRNA的识别，这种修饰策略最初由宾夕法尼亚大学发明并最终将专利卖给了Cellscript。
Moderna在成立之初的重点之一，就是找到能够绕开假尿嘧啶专利的新的修饰方法，并且似乎是成功了——Moderna找到了1-甲基假尿嘧啶，并终于在年获得了多项专利授权。但令人玩味的是，年6月，Moderna仍然选择了从Cellscipt购买假尿嘧啶核苷修饰方法的专利使用权，并为此先期支付了万美元的专利使用费，以及后续每个产品万美元的里程碑付款和个位数的销售提成。Moderna现在的产品线是否有专利护城河保卫，令人生疑。
生辉观点
mRNA疫苗生产工艺简单、合成快速、成本较低，本身具有激活免疫反应的佐剂作用。Moderna、CureVac等公司融资金额已经很高，但最快的临床试验仅进展到II期，由于动物环境和人体环境差异较大，递送系统在人体内效率、mRNA稳定性等都需要大量临床实验予以进一步验证。
国内方面，依托于重大高校科研专利，斯微(上海)生物科技有限公司﹑艾博生物医药（杭州）有限公司﹑上海蓝鹊生物医药有限公司在新冠疫苗的研发方面取得重要进展，尽管尚未进入临床试验阶段，安全性和有效性有待确认。
当前，mRNA疫苗的研究还集中于增强其稳定性、调节其免疫原性、发展新的传递技术、拓展更广的疾病治疗范围等方面，开发出成熟的药物仍有待时日。