点评
董晨院士(上海市免疫治疗创新研究院)、林欣教授(清华大学)
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法是近年来兴起的一种新型过继免疫疗法。它将患者T细胞在体外进行基因改造,使T细胞表达识别肿瘤特定抗原的单链抗体和T细胞活化的信号结构域,经过体外扩增后回输至患者体内,从而实现肿瘤的靶向杀伤。近些年,CAR-T疗法得到了迅猛的发展,目前已有六款CAR-T产品被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于血液肿瘤的临床治疗,标志着CAR-T技术的巨大成功。但是,现有CAR-T技术依然存在一些尚未解决的问题,包括生产成本高、制备时间长、工艺复杂、存在潜在的安全隐患、临床安全性和有效性有待提高等。当前,CAR-T细胞的制备主要是通过慢病毒感染的方式实现的,一方面病毒通过随机整合的方式将CAR序列插入到T细胞基因组中,增加了潜在的致瘤风险。另一方面,T细胞可能会对病毒来源的DNA产生更多的免疫反应从而阻碍CAR的持续表达,而且病毒的工业化制备需要高昂的成本。有研究报道可以利用转座子系统来制备CAR-T细胞,以解决使用病毒载体带来的弊端。最近,有多项研究表明结合CRISPR/Cas9基因编辑技术和使用腺相关病毒(AAV)进行模板递送,可以成功制备定点整合型CAR-T细胞。但是,这些方法仍然无法同时解决使用病毒和随机插入这两大问题。因此,亟需开发新一代的CAR-T技术来更好地解决这些问题。
年8月31日,来自华东师范大学生命科学学院张楫钦、刘明耀、杜冰、李大力团队、浙江大医院黄河团队等合作在Nature上在线发表了题为Non-viral,specificallytargetedCAR-TcellsachievehighsafetyandefficacyinB-NHL的研究论文,首次报道了一种创新性非病毒定点整合CAR-T技术的开发及其治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤的临床试验结果。该技术可以在不使用病毒载体的情况下,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CAR序列定点插入到T细胞基因组的特定位点,一步实现CAR稳定整合和内源基因调控,有效解决了目前CAR-T技术存在的使用病毒和随机插入这两大问题。
为了在T细胞中提高大片段CAR序列在基因组特定位点的整合效率,研究人员首先对制备方法进行了摸索和优化。经过比较,发现当使用同源臂长度为bp的线性双链DNA作为模板时,可以通过同源介导修复(HDR)机制获得数量最多的CAR整合细胞。在此基础上,研究人员选择在安全位点AAVS1制备靶向CD19的定点整合型CAR-T细胞(AAVS1-19bbz),并与传统慢病毒感染的CAR-T细胞(LV-19bbz)进行比较,对该技术的可行性进行概念验证。检测结果显示CAR序列在AAVS1位点的平均整合效率为10%左右,最高可达19.8%。体外增殖、表面标志物表达、细胞因子分泌、体外肿瘤杀伤、小鼠体内肿瘤杀伤等检测表明AAVS1-19bbz与LV-19bbz具有相似的生物学特性,可以有效地杀伤肿瘤靶细胞,初步证明了非病毒定点整合CAR-T技术的可行性。
PD-L1/PD1信号通路是抑制T细胞功能的重要免疫检查点,目前针对PD-L1/PD1的抑制剂已经在多种类型的恶性肿瘤中取得了良好的疗效,也有不少研究报道了PD1敲除可以有效增强CAR-T细胞的功能。因此,研究人员进一步地制备了靶向CD19非病毒PD1定点整合CAR-T细胞(PD1-19bbz),并开展了系统的研究。在PD1位点,CAR序列的平均整合效率可达20%左右,最高为30.3%。与之前报道相一致,PD1下调并不会影响CAR-T细胞响应肿瘤靶细胞后表面标志物表达和细胞因子分泌。为了更好地研究PD1-19bbz的功能,研究人员采用慢病毒感染结合基因编辑的方法制备了PD1敲除的CAR-T细胞(LV-19bbz_PD1-KO),并与LV-19bbz、AAVS1-19bbz和PD1-19bbz进行了平行比较。在小鼠体内肿瘤杀伤实验中,相比于其他组别,PD1-19bbz无论在PD-L1高表达还是低表达的肿瘤细胞中,都体现出更强大、更持久的杀伤效果,小鼠生存率得到显著提高。这提示PD1下调与非病毒定点整合CAR-T细胞制备方法可以联合提高CAR-T细胞的抗肿瘤功能。单细胞测序结果显示非病毒定点整合CAR-T细胞制备工艺本身能显著提高记忆性T细胞的比例,而PD1表达下调可以有效增强T细胞的抗肿瘤免疫功能,为这一现象提供了合理的机制解释。
在这些临床前研究的基础上,研究人员进一步开展了PD1-19bbz治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤的临床试验,对非病毒定点整合CAR-T细胞的临床安全性和有效性进行评估。在接受治疗的8例患者中,未观察到CAR-T治疗相关的神经毒性和2级以上的细胞因子风暴,证明了PD1-19bbz具有出色的临床安全性。检测结果显示PD1-19bbz回输后能在体内快速扩增并维持较长时间。接受治疗后,有87.5%(7/8)的患者获得了疾病完全缓解(CR)的效果,所有患者均对治疗响应,客观缓解率(ORR)为%,其中有5例患者响应时间超过1年。值得一提的是,无论是针对PD-L1高表达肿瘤患者的治疗,还是在CAR-T细胞回输剂量和阳性率较低的条件下,PD1-19bbz均显示出良好的疗效,证明了其具有强大的肿瘤杀伤能力。研究人员对回输前后的CAR-T细胞进行了单细胞测序,结果显示回输前PD1-19bbz中存在较高比例的记忆性T细胞,回输后PD1低表达的CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤功能,回输后存续的CAR-T细胞倾向于维持记忆性细胞的状态,为全面了解PD1-19bbz回输前后状态的变化并解释其临床表现提供了数据支持。
综上所述,针对CAR-T细胞治疗领域存在的痛点,本研究开发了一种全新的非病毒定点整合CAR-T技术,并通过临床试验证明了其临床治疗的安全性和有效性。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,该技术可以在不使用病毒载体的情况下,通过一步制备获得基因组精确整合的CAR-T细胞,同时实现CAR稳定表达和内源基因调控,有效解决了目前CAR-T技术存在的使用病毒和随机插入这两大问题。相比于其他现有CAR-T技术,该技术具有生产成本低、制备时间短、工艺简单、产品均一性高等优点,能有效增强CAR-T细胞临床治疗的安全性和有效性。本研究证明了基因编辑技术在免疫细胞治疗应用中的可行性和安全性,为解决CAR-T治疗领域现存的问题提供了新的方法和思路,对推动CAR-T技术的进一步发展有着重要意义。
论文审稿人、UCLA的JustinEyquem教授评论该工作:“这项研究报道了首个PD1下调定点整合型CAR-T细胞的临床试验。研究人员在临床治疗中观察到了高比例的肿瘤完全缓解率,且未发现严重的毒副作用,这一令人惊喜的结果显示出这种CAR-T疗法具有出色的临床安全性和有效性。研究人员同时也证明了非病毒定点整合T细胞治疗在临床应用的可行性。这一技术创新为未来更多基因靶向修饰CAR-T疗法的发展奠定了坚实的基础,对领域发展具有重要的推动作用。”
Nature杂志资深编辑VictoriaAranda评价该工作:“这项研究工作开展了全面系统的临床前研究,成功开发了非病毒定点整合CAR-T疗法。研究人员展现了令人鼓舞的早期临床试验结果,显示出这种疗法在非霍奇金B细胞淋巴瘤中具有出色的安全性和有效性。”
图:PD1定点整合CAR-T细胞(红色)正杀灭肿瘤细胞(深蓝色);未编辑的T淋巴细胞(绿色)无法有效杀伤肿瘤细胞(亮蓝色)
华东师范大学生命科学学院张楫钦副研究员为论文第一作者、共同通讯作者,浙江大医院黄河教授为论文通讯作者,华东师范大学生命科学学院刘明耀教授、杜冰教授、李大力研究员为论文共同通讯作者。浙江大医院胡永仙教授、华东师范大学生命科学学院杨佳璇硕士为本文共同第一作者。
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