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Toll/interleukin-1receptor(TIR)结构域是动物和植物免疫系统的经典成份，可以识别入侵病原体的分子元件。在人类中，Toll-like受体中的TIR结构域通过蛋白-蛋白相互作用传递信号；在植物中，含有TIR结构域的免疫受体通过感知胞内病原体，触发TIR结构域产生一种环状ADP-核糖变异分子（Variantofcyclicadeninediphosphateribose,v-cADPR），最终造成细胞死亡（称为超敏反应），阻止病原体的繁殖和传播；TIR结构域也被证明是真核细胞免疫系统Thoeris中的一个关键成份，可以保护细菌免受噬菌体感染。Thoeris包含2个核心蛋白，其中的ThsB蛋白含有一个TIR结构域。最近有研究发现Thoeris的另一个核心蛋白：non-TIR蛋白ThsA具有NADase活性，暗示Thoeris防御涉及NAD+水解，可能造成感染后细胞死亡。目前关于植物TIR如何介导细胞死亡及细菌Thoeris系统的抗病毒分子机制均不清楚。
年12月1日，来自以色列魏茨曼科学研究所的RotemSorek团队与GilAmitai团队合作在Nature杂志上在线发表了题为AntiviralactivityofbacterialTIRdomainsviaimmunesignallingmolecules的研究论文，揭示了细菌中Thoeris免疫系统介导的抗病毒信号通路，其在植物和细菌免疫中都是保守的。该研究还追踪了细菌和真核生物的TIRs之间可能的功能和进化联系。
许多细菌防御系统在噬菌体感染时通过触发细胞死亡来保护细菌，这一过程被称为顿挫感染（abortiveinfection,病毒进入宿主细胞，若细胞缺乏病毒增殖所需的酶、能量及必要的成分，则病毒不能合成自身成分；或虽合成部分或全部成分，但不能装配和释放出有感染性的病毒颗粒）。作者发现Thoeris系统可以使被感染细胞在噬菌体子代成熟之前死亡（图1c），说明其主要通过abortiveinfection实现抗病毒功能。Thoeris系统包含两个基因：thsA和thsB，二者必须同时存在才能实现Thoeris的防御功能。ThsB包含一个TIR结构域，而ThsAN端有一个sirtuin（SIR2）结构域（图1a）。近期研究表明，ThsA中的SIR2结构域具有催化NADase活性。在其他噬菌体防御系统中，NAD+的缺失与abortiveinfection有关，同时有研究推测ThsA引起的NAD+缺失与Thoerisabortiveinfection有关。为了验证这一观点，作者采用LC-MS对噬菌体感染过程中的NAD+水平进行了监测。结果显示，在SPO1噬菌体感染后60分钟左右，仅在表达Thoeris的细胞中观察到NAD+的完全缺失（图1d），说明ThsA的NADase活性是导致NAD+耗竭的原因。
图1.Thoeris引起abortiveinfection和NAD+耗竭
作者推测，在响应噬菌体感染时，ThoerisTIR蛋白可能会产生一种信号分子，类似于植物TIR生成的v-cADPR，这种信号分子可以触发ThsA的NADase活性，随后导致abortiveinfection。为了验证这个假设，作者在B.subtilis细胞中只表达ThoerisThBTIR蛋白，并用噬菌体SPO1对这些细胞进行感染。如图2a所示，在感染中的多个时间点裂解被感染的细胞，并过滤裂解液，使其只含有小于3KDa的分子，接着将纯化后的ThsA蛋白与这些裂解液在体外进行孵育，评估这些裂解液是否影响ThsA的NADase活性。结果显示，当与表达含有TIR的ThsB蛋白的被感染细胞裂解液共同孵育时，ThsA表现出显著的NADase活性；与对照组细胞裂解液孵育时，ThsA的NADase活性并不会被触发（图2b），说明在噬菌体感染期间，ThoerisTIR蛋白产生了一种小分子具有激活ThsA的NADase活性的能力。为了进一步探究细菌TIR产生的分子对ThsA的激活是否与植物TIRs产生的分子类似，作者在E.coli细胞中过表达了植物的含TIR结构域的蛋白BdTIR（其可以持续地产生v-cADPR），并获取了其细胞裂解液。发现从表达BdTIR的E.coli中获得的裂解液也可以触发ThsA的NADase活性（图2c），说明细菌ThoerisTIR和植物BdTIR在功能上相似，二者产生的第二信使均可以激活Thoeris效应蛋白。
图2.ThsA的NADase活性由表达TIR的感染细胞产生的小分子触发
为了进一步揭示ThoerisTIR蛋白产生的信号分子的本质，作者采用了非靶向LC-MS分析在SPO1噬菌体感染过程中表达ThoerisThsBTIR蛋白的B.subtilis细胞的代谢产物。在感染后45min的样品中检测到了一种独特的分子，这种分子在未感染或感染后的早期时间点中检测不到，说明这种分子是TIR蛋白在响应噬菌体感染时产生的。进一步分析发现，该分子的分子质量接近于cADPR的分子质量，但其在结构上不同于经典的cADPR，是一种cADPR异构体。
ThsA除了N端的SIR2NADase结构域外，还有一个位于C端的SLOG结构域。SLOG结构域被认为可以结合核酸来源的信号分子（例如ADPR）。TRPM家族阳离子通道中含有SOLG同源结构域，其可以被ADPR和它的衍生物触发。结构分析发现ThsASLOG结构域与TRPM2SLOG结构域的ADPR结合口袋区域在结构上具有同源性，因此推测当TIR产生的cADPR异构体结合到ThsAC端SLOG结构域时可以激活ThsA。作者将ThsASLOG结构域中的活性位点进行突变后（RA），Thoeris对噬菌体的防御能力丧失。接下来，作者检测了野生型ThsA和突变体暴露在信号分子cADPR异构体中的多聚状态：在没有信号分子时，大多数的ThsA蛋白以一种单体或四聚体的形式存在；当存在信号分子时，大部分的ThsA蛋白转变了它们的多聚状态，主要以二聚体形式存在。因为暴露在信号分子下可以激活ThsA的NAD+降解活性，因此这些数据说明观察到的多聚状态的转变反应了ThsA酶的活化。进一步分析发现ThsARA突变体在响应信号分子时不能发生多聚状态的转变。这些数据说明ThsA的SLOG结构域驱动其多聚状态变化，以响应TIR衍生的cADPR异构体信号，从而激活SIR2结构域的NADase活性。
在自然的Thoeris系统中，thsASIR2结构域基因通常伴有多个thsBTIR结构域基因。在同一位点的不同thsB基因之间往往存在差异，除了TIR结构域及其保守活性位点的一般结构外，通常很少有序列同一性。作者发现同一位点内不同的ThsB蛋白负责识别不同的噬菌体相关分子模式，这与真核免疫系统中TIR结构域蛋白的作用类似，说明Thoeris防御特异性取决于TIR结构域蛋白的特性。
总的来说，该研究阐释了Thoeris抗噬菌体防御系统的作用机制。如图3所示，TIR结构域蛋白ThsB负责识别噬菌体感染，一旦感染被检测到，TIR结构域就会变得具有酶活性，并催化cADPR异构体分子的产生；这一分子反过来作为一种信号分子，通过与ThsAC端SLOG结构域相结合，改变ThsA的多聚体状态激活ThsA的NADase活性，然后NADase效应从细胞中耗尽NAD+，产生无法支持噬菌体复制的细胞条件并导致细胞死亡。该文章证实了TIR来源的cADPR异构体可以作为免疫第二信使，同时对将来植物模型系统的研究提供指导信息，以揭示这种TIR产生的分子在植物对病原体的免疫反应中的作用。该研究使得我们可以真正在机制上理解免疫系统，将有助于我们从容地面对新出现的病原体。
图3.Thoeris系统的作用机制模型
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